柱外體積是液相色譜中死體積重要的組成部分，它包括進(jìn)樣器體積，混合器體積，色譜柱前后連接管路的體積，連接配件等所產(chǎn)生的空間，以及檢測(cè)器流通池體積。根據(jù)您使用的系統(tǒng)和應(yīng)用，在HPLC上開(kāi)發(fā)超高性能方法需要優(yōu)化上述配件以減少柱外體積。

測(cè)量柱外體積的方法

等度法

等度方法的系統(tǒng)體積測(cè)量相當(dāng)簡(jiǎn)單，可以直接在系統(tǒng)上進(jìn)行，而無(wú)需更改流動(dòng)相。首先，取出HPLC色譜柱并用零死體積兩通替換色譜柱。然后以固定流速啟動(dòng)HPLC，并在系統(tǒng)中注入少量丙酮或其他有UV吸收組分，并在270nm或220nm處進(jìn)行監(jiān)測(cè)。從丙酮進(jìn)樣到色譜圖中開(kāi)始出峰的時(shí)間表明了系統(tǒng)的柱外體積。計(jì)算方法如下：

調(diào)整進(jìn)樣器和色譜柱入口之間的流路以及柱后流路可以減小該體積。

梯度法

雖然梯度法的柱外體積測(cè)量并不像等度法那么簡(jiǎn)單，但它操作起來(lái)也并不復(fù)雜。首先，取出HPLC色譜柱并用零死體積兩通替換色譜柱。一個(gè)流動(dòng)相是水，另一相是乙腈，并在流動(dòng)相B中添加一定量的丙酮，此時(shí)需要切換流動(dòng)相，并在適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)下監(jiān)測(cè)紫外線以檢測(cè)丙酮（220nm或270nm都可以）。梯度法即系統(tǒng)保持在100%A（1-2分鐘），然后在幾分鐘內(nèi)從0%至100%B梯度。從梯度開(kāi)始時(shí)間到UV信號(hào)基線上升的時(shí)間延遲即為總的系統(tǒng)體積。計(jì)算也很簡(jiǎn)單：

梯度法柱外體積測(cè)試方法作為優(yōu)化HPLC系統(tǒng)的重要工具，以更好的配合核殼填料（Kinetex）的柱效優(yōu)勢(shì)。在柱外體積測(cè)試期間，也可以交替使用進(jìn)樣器旁路與主路，以查看進(jìn)樣器回路對(duì)整個(gè)HPLC系統(tǒng)死體積的影響。